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아프리카돼지열병 백신 후보 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR은 상동성 악성 챌린지(homologous vilutent challenge)를 예방하고 항체의 장기 유지를 나타냅니다.
곁에
,
,
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최선아
1,†,
김연지
2,3,†,
이수진
1,
문성철
1,
안근승 (Keun Seung Ahn)
1,
싱화 젱
1,
김도순
1,
이세영
1,
신승표
1,
동섭 타크
4,
김원준
2,
신용우
2,
원화 정
2,* 그리고
수르(Jung Hyang Sur)
1,*
1
중앙연구개발원, 코미팜국제(주), 시흥시 15094, 대한민국
2
환경부 국립야생동물질병통제예방연구소(NIWDC) 야생동물질병대응팀 광주광역시 62407
3
충남대학교 수의과대학, 대전 34134, 대한민국
4
전염병예방연구실 수의과대학 인수동식물연구소, 전북대학교, 익산 54531, 대한민국
*
서신을 보내야 하는 저자.
†
이 저자들은 이 작업에 동등하게 기여했습니다.
동물 2025, 15(4), 473; https://doi.org/10.3390/ani15040473
제출 접수일: 2025년 1월 2일 /
개정: 2025년 1월 30일 /
수락됨: 2025년 2월 4일 /
게시됨: 7 2월 2025
(이 기사는 돼지 섹션에 속합니다.)
간단한 요약
아프리카 돼지 열병은 전 세계 돼지 산업에 큰 위협이 되고 있습니다. 이 질병은 한때 특정 지역에 국한되어 있었습니다. 그러나 현재 대륙을 가로질러 빠르게 확산되고 있습니다. 이로 인해 연구자들과 양돈 농가들 사이에서 우려가 제기되고 있다. 따라서 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 백신 개발은 최근 수의학 연구의 최우선 과제가 되었습니다. 이 연구에서 첫 번째 그룹은 백신 접종 후 이의를 제기한 반면, 두 번째 그룹은 백신을 단독으로 접종했습니다. 전자군은 백신의 효능과 안전성을 확인했고, 후자군의 높은 항체 수치는 약 2개월 동안 안정적으로 유지됐다. 우리의 발견은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 매우 독성이 강한 현장 균주에 대한 백신의 방어 잠재력을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다.
추상적인
아프리카돼지열병 바이러스(ASFV)는 전 세계적으로 크게 확산되어 돼지 산업에 상당한 경제적 손실을 초래했습니다. 광범위한 연구에도 불구하고 어떤 ASF 백신도 약독화 생백신의 효과를 능가하지 못했습니다. 예를 들어, 약독화 생백신인 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR은 백신 접종 후 ASF 항체가 오래 지속되는 동시에 우수한 효능과 안전성을 입증했습니다. 따라서 농장 환경의 변화를 기반으로 독성이 높은 상동 ASF 바이러스에 대한 보호 가능성을 평가하고자 했습니다. 이를 위해 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR로 근육내 면역 후 ASFV의 악성 필드 균주를 가진 국내 돼지에 도전했습니다. 우리는 또한 면역된 국내 돼지에서 그것의 게놈 안정성과 장기 항체 지속성을 평가했다. 백신을 접종한 모든 돼지는 높은 항체 양성률을 보였으며 챌린지 당시 더 높은 수준의 항체가 관찰되었습니다. 이러한 높은 ASF 백신 항체는 접종 후 약 2개월 동안 유지되었습니다. 또한, 백신을 접종한 동물에서 장기 또는 조직 손상이 관찰되지 않았다. 우리의 연구 결과는 이 백신 후보가 돼지 산업의 ASFV 감염 예방에 적용 가능하다는 것을 보여줍니다.
1. 소개
아프리카돼지열병(ASF)은 농장에서 사육하는 멧돼지와 야생 멧돼지 모두에게 영향을 미치는 치명적인 질병입니다. ASF는 아프리카에서 유럽을 거쳐 동남아시아와 북아시아의 대부분의 국가로 퍼져 나갔으며, 이곳에서는 풍토병
이 되었습니다[
1,2]. ASF 발병은 2018년 중국에서 처음 보고된 이후 대부분의 아시아 국가에서 상당한 경제적 손실을 초래했습니다[
3]. 이 질병은 다양한 요인에 따라 매우 심각한 감염에서 무증상 감염에 이르기까지 다양한 형태로 나타납니다[
4,5].
ASF는 아프리카돼지열병 바이러스(ASFV)에 의해 발생하며,
Asfarviridae과와
Asfivirus 속으로 분류됩니다. ASFV는 길이가 170-190kbp인 이중 가닥 DNA 게놈을 가지고 있으며, 이는 주로 왼쪽 및 오른쪽 말단 게놈 영역의 결실 및 삽입으로 인해 발생합니다[
6,7,8].
25개의 ASFV 유전자형에 대한 효과적인 예방 또는 치료 전략은 아직 개발되지 않았습니다. 대부분의 국가에서 이 질병의 표준 관리는 엄격한 가축 도태입니다. ASF는 국내 수텅이, 야생 수텅, 야생 수텅을 포함한 전 세계 돼지 산업에 심각한 위협이 되고 있습니다[
9,10,11].
이 질병은 100년이 넘었습니다. 초기 발병은 주로 아프리카 대륙에 국한되었지만, 2007년 이후 ASF 발병 빈도가 증가했습니다[
12]. 이 질병은 돼지고기 산업과 세계 식량 안보에 지속적인 위협이 되고 있으며, 결과적으로 가격, 생산 및 국제 무역에 영향을 미치고 있습니다. 돼지고기는 전 세계 육류 소비의 36%를 차지하여 두 번째로 많이 소비되는 단백질 공급원입니다. 따라서 ASF를 근절하는 것은 지속 가능한 돼지 생산을 보장하기 위한 중요한 우선 순위입니다[
13].
약독화 생백신(LAVA)을 생산하기 위한 시도가 진행 중입니다. 지난 수십 년 동안 불활성화 백신, 재조합 서브유닛 백신, 벡터 백신 및 LAV 균주를 포함한 다양한 ASF 백신 후보가 개발되었습니다[14,15,16,17,18
].
그러나 백신의 안전성에 대해서는 아직 연구가 부족합니다. LAV에 대한 임상시험은 ASFV에 대한 보호를 일관되게 입증했습니다. 따라서 LAV는 현재까지 ASFV 감염을 예방하는 가장 효과적인 방법으로 간주됩니다[19,20,21,22,23,24
].
ASFV-G의 유전체에서
I177L 유전자를 삭제하여 얻은 약독화 생백신 후보물질인 ASFV-G-ΔI177L이 최근 개발되었다[
19]. 이 백신 후보물질의 안전성은 고용량 비경구 접종에서도 입증되었습니다. 상대적으로 적은 용량에서도 매우 독성이 강한 부모 변종 ASFV-G에 대한 방어를 효과적으로 유도할 수 있습니다. 그러나 이 약독화 바이러스는 돼지 대식세포의 1차 배양에서만 복제되기 때문에 상업적인 대량 생산에 어려움이 있습니다. 이에 새로운 백신 후보물질인 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR이 개발되었습니다. 이 백신 균주는 ASFV-G-ΔI177L에서 파생되었으며 Plum Island 돼지 상피 세포(PIPC)에서 효율적으로 복제되는 좌측 가변 영역(LVR)이 결실되었습니다[
20].
ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR의 안전성, 면역원성 및 효능은 ASFV-G-ΔI177L과 동등한 것으로 간주됩니다. 그러나 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR은 기존 세포주에서 복제할 수 있도록 합리적으로 설계된 최초의 고효율 ASF 백신 후보물질로 상용 백신 생산에 적합합니다[
20].
본 연구에서는 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신의 효능, 안전성 및 장기 항체 지속성을 평가하는 것을 목표로 하였다. 이번 연구 결과는 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 후보물질이 양돈산업의 ASF 감염 예방에 중요한 역할을 할 수 있음을 확인시켜준다.
2. 재료 및 방법
2.1. 세포 배양과 바이러스
세포 배양을 기반으로 한 Mast Seed Virus(MSV)를 생산하려면 배양의 용이성, 통과 중 유전적 안정성 및 높은 바이러스 수율이 필요합니다. 따라서 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, WOAH)[25]에서 제시한 품질 표준을 준수하는 것이 중요합니다. MSV의 생물학적 특성은 다음과 같이 특징지어졌습니다. 백신 후보 균주인 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR은 처음에 미국 농무부(USDA)에 의해 PIPEC에서 배양된 8차 통로 ASF 약독화 생백신(ASF-LAV)으로 제공되었습니다. USDA에서 제공하는 백신 균주를 사용한 PIPEC 통로에 대한 간략한 설명은 다음과 같습니다. PIPECs는 소 αVβ6 인테그린을 안정적으로 발현하는 돼지 태아 신장 세포주의 서브클론입니다(20). 간략하게, PIPEC 배양은 10% 소 태아 혈청(FBS; HyClone Laboratories, Logan, UT, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 2mM L-글루타민. 세포는 5% CO가 있는 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양했습니다.
2
. 세포 통로는 7-10일마다 수행되었습니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 mCherry 발현을 판독합니다[20]. 첫 번째 도입부 후에 또 다른 구절이 추가되어 아홉 번째 단락(P9)이 생성되었습니다. 그 후, 세포는 10 개의 추가 통로를 거쳤습니다. 가장 높은 백신 역가를 보인 것은 MSV(ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR-P19)로, 다양한 유전자 변형으로 확인되었습니다.
바이러스 적정은 96웰 플레이트에 파종된 1차 돼지 대식세포 배양을 사용하여 수행되었습니다. 바이러스의 연속 희석액을 준비하여 대식세포 배양액에 접종하고, 대식세포 특이적 배지에서 유지하였다. 바이러스 존재는 혈액흡착(HA) 분석을 통해 평가되었으며, 감염된 대식세포에 대한 적혈구 부착은 바이러스 복제의 지표 역할을 합니다. 50% 혈흡착 선량을 결정하기 위해 Reed and Muench 방법을 사용하여 바이러스 역가를 계산했습니다[
26].
사육 돼지는 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 후보물질로 면역되었습니다. 독성이 강한 한국/야생멧돼지/ASFV-화천/2020 균주(GenBank 등록 번호: OR159219.1)가 동물 챌린지에 사용되었습니다. 이 현장 격리 균주는 대한민국 환경부에서 제공했습니다.
2.2. 동물실험
동물실험은 한국인수공통전염병연구원에서 동물생물안전성 3등급(ABSL-3) 조건에서 진행되었다. 모든 실험 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 JBNUNON 01-022-2023 및 JBNUNON 2024-049)의 승인을 받았습니다. 실험 동물은 7-8주 된 상업용 품종 돼지였습니다. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신후보물질은 실험에 영향을 미칠 수 있는 주요 돼지 질병인 돼지 써코바이러스 2, 마이코플라스마 폐렴균, 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 접종 전 혈청학적 음성을 확인한 후 사용하였다. 동물은 근육 내 면역을 위해 두 그룹(그룹 A 및 B)으로 나뉘었습니다.
그룹 A(1-4)에 1mL의 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR을 10mL로 근육 주사했습니다.
2.25
티씨디
50
. 다음으로, 돼지들은 10으로 도전했습니다.
2
했다
50
독성이 높은 한국 ASFV 필드 균주 화천/2020 백신 접종 후 28일 후 근육 주사(dpv). 그런 다음 전혈, 직장 및 구강 면봉을 포함한 샘플을 백신 게놈 복사 및 항체 식별을 위해 각각 0, 4, 7, 10, 14, 18, 21, 25 및 28 dpv 및 챌린지 후 4, 7, 11 및 14일 후에 수집했습니다. 그룹 A-1(1-4)은 4마리의 돼지로 구성되었으며 10마리 1mL로 근육 주사를 맞았습니다.
2
했다
50
화천/2020 균주의. 백신을 접종하지 않은 대조군(A-2; 1-4)은 추가 조치 없이 사육된 4마리의 동물로 구성되었다(표 1). 혈액, 직장 및 구강 면봉 검체 채취 일정은 그룹 A와 동일했으며 임상 징후, 직장 온도 및 생존율을 매일 기록했습니다. 챌린지 백신 접종(14 dpc)으로 죽거나 생존한 후 안락사된 동물은 병리학적 분석을 위해 부검되었습니다.
B군(1-4)은 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신을 단독으로 접종한 후 백신의 면역원성과 안전성을 확인하기 위해 최대 56일 동안 백신 게놈 사본 및 항체의 지속성을 검사했습니다. 그룹 B는 두 개의 하위 그룹으로 더 나뉩니다(표 1). 먼저 돼지 4마리에 10마리를 접종했다.
3
티씨디
50
ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR(1mL)을 근육내 투여로 투여하고, 백신의 안전성을 56일 동안 이의 없이 모니터링하였다. 백신 게놈 사본과 항체를 분석하기 위해 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24, 28, 32, 35, 39, 42, 46, 49, 53, 56dpv에서 전혈, 직장 및 경구 검체를 수집했습니다. 백신을 접종하지 않은 대조군인 B-1군(1-2)에서는 2마리의 동물을 56일까지 사육했습니다. 전혈, 직장 및 구강 샘플은 그룹 B에 대한 샘플과 동일한 간격으로 수집되었습니다.
2.3. ASFV 게놈 검출을 위한 정량적 실시간 PCR(qPCR)
qPCR은 백신 접종 시 전혈, 직장 및 구강 샘플에서 바이러스를 검출하는 데 사용되었습니다. ASFV DNA는 RSC Whole Blood & RSC Tissue DNA Kit(Maxwell; Promega, Madison, WI, USA) 및 장비(Maxwell CSC 48 Instrument IVD, Promega) 제조업체의 지침에 따릅니다. 전혈 샘플에서 DNA를 정제하는 방법도 비슷합니다. Proteinase K 용액(20μL)을 300μL의 전혈이 들어 있는 각 배양관에 첨가했습니다. 또한 200μL의 용해 완충액을 각 배양 튜브에 첨가했습니다. 각 튜브를 10초 동안 볼텍싱하고 가열 블록(56°C로 설정)에서 20분 동안 배양했습니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제를 수행한 후 50μL의 용출 완충액을 추가하여 DNA를 추출했습니다.
®
®
ASFV 검출(p72 타겟 유전자)에 대해 WOH에서 검증 및 인증한 Vet max™ 아프리카돼지열병 바이러스 검출 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 ASF 특이적 Real-Time PCR을 수행했습니다[
22]. 45< Ct 값은 양성을 나타냅니다.
2.4. ASFV 항체 검출
ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 접종된 동물로부터 전혈을 수득하고, ID 스크리닝 ASFV 경쟁 효소 결합 면역흡착 분석법(cELISA; IDvet, rue Louis Pasteur, Grabels, France). 혈청을 전혈 샘플에서 분리하고, cELISA는 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. S/N%는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.
®
S/N% ≤ 40%의 혈청 샘플은 양성으로 간주되었습니다. 대조적으로, S/N% ≥ 50%인 혈청 샘플은 의심스러운 것으로 간주되어 분석이 반복되었습니다.
3. 결과
3.1. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR의 ASFV FieldStrain 화성화천에 대한 효능 / 2020
그룹 A(1-4)는 10세에 약독화 생ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신으로 근육 면역되었습니다.
2.25
티씨디
50
/1mL/용량으로 이 백신의 안전성과 효능을 확인합니다. 28 dpv로, 10에서 고독성 상동 ASFV 전계 균주(화천/2020) 1mL
2
했다
50
IM에 의해 도전되었습니다. 28 dpv에서 동물에서 특이한 온도 변화가 관찰되지 않았다. 챌린지 후 3마리의 동물에서 체온(40.1–41.5 °C)의 약간의 일시적인 상승이 관찰되었지만, 모두 회복되었고(그림 1) 안락사 전에 특이한 임상 소견은 관찰되지 않았습니다.
그림 1. 백신 접종 후 돼지의 직장 온도와 생존 및 도전. 점선은 40.0 °C에서 발열 역치를 나타냅니다. 검은색 선은 28dpv에서의 도전을 나타냅니다. 빨간색과 파란색 선은 각각 챌린지 감염과 음성 대조를 나타냅니다.
그룹 A-1 (1–4): 양성 대조군은 ASFV 필드 변형으로 3dpc부터 지속적인 고열 및 ASF 관련 증상을 보였습니다. 모든 동물은 도전 후 11일에서 14일 사이에 죽었다.
그룹 A-2 (1–4): 대조적으로, 백신을 접종하지 않은 동물은 관찰 기간 동안 질병의 징후 없이 임상적으로 정상을 유지했습니다.
3.2. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 도전 돼지의 ASF 백신 DNA(ASFV p72 유전자) 평가
Group A (1–4): ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 전혈에서 ASF 유전체를 검출하기 위해
p72 유전자를 타겟으로 Real-Time PCR을 통해 0, 4, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 dpv에서 채취한 검체를 검사하였다. 4 dpv에서 ASFV 게놈의 50%(2/4)는 전혈에서 낮은 검출 수준이었습니다(Ct = 41.10 ± 3.91). 이 게놈은 챌린지 14일째부터 챌린지 시점까지 모든 동물에서 100% 검출 가능(Ct = 31.25 ± 9.69)이 되었습니다. 전혈은 ASF 게놈 검출을 위한 챌린지 후 4일, 7일, 11일, 14일에 수집되었습니다. 4 dpc에서 14 dpc(안락사 시)까지 비교적 일정한 바이러스 게놈이 관찰되었다(Ct = 25.53 ± 6.46) (
표 2).
그룹 A-1 (1–4): 28일째 챌린지 시점까지 바이러스 게놈이 검출되지 않았습니다. 그러나 높은 검출 수준(Ct = 16.68 ± 0.26)은 4–11 dpc에서 관찰되었습니다. 이 무리에 속한 동물들은 모두 죽었다. 그룹 A-2(1–4)는 음성 대조군으로 사용되었으며 ASFV 게놈은 검출되지 않았습니다.
3.3. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 도전 돼지의 ASF 백신 항체 평가
cELISA를 사용한 항체 검출은 S/N%<40%에서 양성 참조로 판독되었습니다. 28차 dpv에서 각 그룹에 이의를 제기하고, 백신에 대한 항체 반응을 평가하기 위해 전혈을 채취하였다(
표 3).
그룹 A (1–4): ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR(25%, 1/4)에서 10 dpv에서 항체 양성이 검출되었습니다. 14일째 모든 백신 접종군에서 낮은(S/N% = 33.85 ± 4.80) 항체 양성률이 확인되었습니다. 또한 항체 양성률(S/N% = 21.75 ± 6.84)은 28일째에도 높은 수준을 유지했습니다. 또한, 동물의 100%는 4–14 dpc에서 생존했으며, 28 dpc 후에도 높은 항체 수준(S/N% = 10.03 ± 2.86) 유지되었습니다.
ASF 양성 대조군인 A-1군(1-4)에서 항체 수치는 7dpc에서 양성 임계값에 근접했습니다. 그러나 11일까지 모든 동물이 감염으로 폐사했습니다. 백신을 접종하지 않은 그룹인 A-2군(1-4)에서는 연구 기간 동안 검출 가능한 ASF 특이 항체가 관찰되지 않았습니다.
3.4. Post-Vaccine Challenge Group 및 Vaccination-Only (Long-Term) Group의 직장 및 구강 면봉에서 ASF 백신 DNA 평가
그룹 A (1–4): 직장 및 구강 샘플에서 ASFV 게놈 검출은 전혈에 비해 현저히 낮은 수준으로 발견되었습니다. 백신 접종 7일째(7 dpv)에 돼지 4마리 중 1마리의 구강에서 처음 검출되었고, 18일째(dpv)에 돼지 4마리 중 2마리의 직장과 구강 모두에서 검출되었습니다. 챌린지 당일인 28일째까지 ASFV 유전체 검출은 백신 접종군의 50% 미만을 유지했다. 챌린지 결과, 14 dpc에서 안락사까지 모든 돼지에서 중간 수준의 ASFV 게놈이 일관되게 검출되었습니다(
보충 표 S1).
그룹 A-1 (1–4): 챌린지 대조군에서 예상했던 바와 같이, 안락사 후 7 dpc에서 직장과 구강에서 높은 수준의 ASFV 게놈이 검출되었습니다(
보충 표 S1).
그룹 A-2 (1-4) : 음성 대조군과 달리 모두 음성으로 확인되었습니다 (
보충 표 S1).
그룹 B (1–4): 백신 접종 7일째(7 dpv)에 돼지 4마리 중 2마리가 직장과 구강에서 ASFV 게놈 수치가 낮은 것으로 확인되었습니다. 14-18일째(14-18 dpv)에 돼지 4마리 중 3마리에서 검출된 후, 56일째(56 dpv)까지 4마리 중 2마리의 돼지만이 ASFV 게놈 수치가 매우 낮은 것으로 밝혀져 안락사되었다. Ct 값에 따르면, 직장 및 구강 검체 중 ASFV 유전체는 구강 검체에서 더 자주 검출되었다(
보충표 S2). 모든 그룹 B-1(1–2) 대조군은 ASFV 게놈 음성이었습니다.
3.5. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 문제가 된 돼지의 병리학적 소견
양성 대조군을 포함한 모든 ASF 백신 접종군에서 죽거나 안락사된 돼지를 부사시켜 전형적인 ASF 병변을 평가했다. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 문제가 발생한 돼지의 림프절(턱밑, 서혜부, 위장관-간 림프절), 비장, 신장 및 폐를 포함한 주요 장기에서 정상적인 소견이 관찰되었습니다(
그림 2 및
그림 3, V1–V4). 조직병리학적 병변에서도 특이한 소견이 나타나지 않았다(
그림 2 및
그림 3, V1-1 - V4-1). 반면, Hwacheon/2020 균주에 도전한 양성 대조군은 대부분의 림프절, 비장, 신장 및 기타 장기에서 전형적인 ASF 병변을 보였다. 가장 두드러진 거시적 병변은 림프계에서 관찰되었습니다(
그림 2, C1–C4).
그림 2. 그룹 A: 챌린지 전에 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신을 접종한 돼지의 턱밑 림프절. 거시적 병변(V1 - V4): 모든 턱밑 림프절은 정상이었다. 미세한 병변 (V1-1 - V4-1) : 턱밑 림프절의 단면. H&E 염색, 백신 접종 후 문제가 된 모든 돼지에서 100배 정상 조직병리학적 소견이 확인되었습니다. 그룹 A-1: 독성이 높은 분리 ASFV에 감염된 돼지의 턱밑 림프절(화천/2020). 거시적 병변 (C1 - C4) : 림프절이 붓고 부종이 있었으며 피질과 수질에 심한 출혈이 있었다. 미세한 병변 (C1-1 - C4-1) : 턱밑 림프절의 단면. H&E 염색, 100x. 눈금 막대 = 100 μm. 심한 림프구성 고갈은 양쪽 림프구 난포에 영향을 미치며 수질의 심각한 출혈, 변연부의 혈액 침윤 및 수많은 혈관의 울혈을 동반합니다.
그림 3. 그룹 A: 바이러스 챌린지 전에 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR을 접종한 돼지의 비장. 거시적 병변 (V1 - V4) : 모든 비장은 크기가 정상이고 붉은색이었다. 미세한 병변 (V1-1 to V4-1) : 비장의 단면. H&E 염색, 백신 접종 후 문제가 된 모든 돼지에서 100배 정상 조직병리학적 소견이 확인되었습니다. Group A-1: Hwacheon/2020 균주에 감염된 돼지의 비장. 거시적 병변 (C1-C4) : 비장은 부서지기 쉬운 (C1) 및 짙은 빨간색에서 검은 색 (C1-C4)과 함께 둥근 가장자리로 크기가 증가합니다. 미세한 병변 : 비장의 섹션 (C1-1에서 C4-1). H&E 염색, 100x. 눈금 막대 = 100 μm. 적혈구 및 대식세포에 의한 치수의 확산성 침투는 풍부한 pyknotic cell과 함께 심각한 림프구 고갈을 보여줍니다.
비장은 둥근 모서리로 상당한 확대를 보였다. 짙은 붉은색으로 보이고 경미한 비장 비대가 특징이었습니다(
그림 3, C1–C4). 림프절이 자주 부어오르고, 부종이 발생하며, 피질과 수질에 출혈이 나타났다. 신장의 경우, 신장 수질 부위에서 심각한 출혈이 뚜렷했으며, 표면의 특징적인 점상 출혈이 포함되었습니다. 림프절에 대한 조직학적 검사에서 미만성, 중등도에서 중증의 충혈이 발견되었으며, 수질동은 단핵 세포에 의해 침윤되어 있고, 핵류증을 겪고 있는 pyknotic 세포, 세포 파편이 있습니다(
그림 2, C1-1 - C4-1). 비장에서도 유사한 소견이 관찰되었는데, 붉은 과육은 적혈구와 pyknotic cell로 가득 찬 심각하고 확산성 출혈성 울혈을 보여주었습니다(
그림 3, C1-1 - C4-1).
3.6. 성장돼지에 대한 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 장기 안전성 평가
그룹 B(1-4)는 약독화 생백신 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR(10
3
티씨디
50
/1mL) 돼지 도입 후 3일 안정화 후 백신의 안전성을 확인합니다. 다만, 56 dpv에 대한 백신 안전성을 검증하였으나 ABSL-3 사용 제한으로 인해 추가 검증이 불가능하였습니다.
일시적인 발열(40.0–41.3 °C)은 그룹 B에서 첫 3일 안정화 기간 동안 관찰되었습니다. 그 후, 안락사 시점까지 발열과 임상적 증상은 관찰되지 않았다(
그림 4). 예상했던 대로, 백신을 접종하지 않은 순진한 동물(그룹 B-1 (1–2))은 관찰 기간 동안 임상적으로 정상을 유지했습니다.
3.7. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 ASF 백신 DNA(ASFV p72 유전자)의 장기 평가
그룹 B (1–4): 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24, 28, 32, 35, 39, 42, 46, 49, 53, 56 dpv에서 수집된 전혈 검체는 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 ASF 게놈을 검출하기 위해 p72 유전자를 표적으로 하는 Real-Time PCR을 통해 검사했습니다. 4 dpv에서 동물의 75%(3/4)가 중간 수준의 ASFV 게놈을 가지고 있었습니다(Ct = 35.93 ± 6.61). ASFV 게놈은 안락사 시점인 56일까지 모든 동물에서 검출되었습니다. 28 dpv (Ct = 24.68 ± 2.32)에서 ASF 게놈은 비교적 높은 수준으로 검출되었습니다. 그러나 ASFV 게놈 수치는 46 dpv까지 점진적으로 감소하였으며, 56 dpv에서 더 낮은 수치가 확인되었다(Ct = 31.18 ± 1.96)(
표 4). 백신을 접종하지 않은 모든 그룹 B-1(1-2) 대조군은 ASFV 게놈 음성이었습니다.
3.8. 예방접종 후 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 항체의 장기 평가
그룹 B(1–4): ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 11일차에 항체 양성이 검출되었습니다(50%, 2/4). 24일째와 28일째에 모든 백신 접종군에서 중등도(S/N% = 19.05 ± 4.76) 및 높음(S/N% = 12.33 ± 5.22) 수준의 항체 양성률이 검출되었습니다. ASF 항체 수치는 42 dpv에서 더 높았다(S/N% = 7.23 ± 2.25). 이 수치는 ASF 백신 접종 후 약 2개월 후인 56 dpv에서 더욱 높았습니다(S/N% = 5.38 ± 2.24). 백신을 접종하지 않은 모든 그룹 B-1(1-2) 대조군은 ASF 항체 음성이었다(
표 5).
3.9. ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 장기 병리학적 평가
그룹 B: ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR을 접종한 돼지에서 대부분의 림프절(턱밑, 서혜부, 위장관-간림프절)과 비장을 포함한 주요 장기는 정상이었습니다(
그림 5, V1–V4). 마찬가지로, 백신을 접종하지 않은 순진한 동물의 림프절과 비장에서 거시적 병변이 관찰되지 않았습니다(
그림 5, C1–C2). 또한, 백신을 접종한 동물과 접종하지 않은 동물 모두의 대부분의 주요 장기에서 조직병리학적 병변이 관찰되지 않았다.
그림 5. 그룹 B: ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신을 접종한 돼지의 턱밑 림프절. 거시적 병변(V1 - V4): 장기간 백신을 접종한 돼지의 턱밑 림프절은 정상이었다. 그룹 B-1: 백신을 접종하지 않은 돼지의 턱밑 림프절(음성 대조군). 거시적 병변(C1 - C2): 모든 턱밑 림프절은 정상이었다. 그룹 B: ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR이 접종된 돼지의 비장. 거시적 병변(V1 - V4): 장기간 백신을 접종한 돼지의 비장은 정상이었고 밝은 붉은색을 보였다. 그룹 B-1: 백신을 접종하지 않은 돼지의 비장(음성 대조군). 거시적 병변(C1 - C2): 모든 비장이 정상이었다.
4. 고찰
"로마는 하루아침에 만들어지지 않았다"는 말은 ASFV 박멸을 위한 연구 노력에 대해 사실로 들립니다. ASFV는 1921년 아프리카에서 처음 보고된 치명적인 돼지 질병입니다[
27]. 1957년에 유럽 대륙에 전파되었고, 그 후 동유럽과 아시아로 퍼져 나갔다. 이 질병의 전 세계적인 확산은 돼지 산업에 치명적입니다[
16]. 이에 따라 다양한 형태의 후보 백신이 개발되고 있습니다. 또한 임상시험은 수십 년 동안 진행되어 왔습니다. 현재까지 25개의 ASFV 유전자형이 확인되었으며 교차 반응이 부족합니다[
10].
ASF 팬데믹에 대응하기 위해 유전자 조작 약독화 생백신이 개발되었습니다. 여기에는 상동 재조합을 통해 생산된 결실 돌연변이 백신이 포함됩니다. 이러한 유망한 ASF 백신 후보는 현재 진행 중인 임상시험에서 평가가 진행 중입니다. ASF 약독화 생백신(ASF-LAV) 개발 현황 보고서에 보고된 바와 같이 합리적인 약화를 보인 최초의 백신 바이러스 중 하나는 "ASFV-G-∆9GL"[
28]입니다. 이 바이러스는
영국 유전자의 추가적인 결실로 감소된 잔류 독성을 가지고 있습니다[
29]. 또 다른 유망한 백신 후보인 "BA71∆CD2"는 강력한 체액성 및 세포 반응을 유도하고 상동 바이러스에 대한 교차 보호 가능성을 보여주었습니다[
30].
또 다른 유망한 백신 후보인 HLJ/18-7GD는 돼지에서 완전히 약독화되었습니다. 이 백신 균주는 7개의 유전자가 결실되는 것이 특징입니다. 독성 균주로 변이될 위험이 낮고 돼지의 치명적인 ASFV 챌린지에 대한 강력한 보호를 유도할 수 있습니다[
31]. 특히 "ASFV-G-∆I177L"[
19] 및 "ASFV-G-∆MGF"[
32]는 낮은 백신 유발 바이러스 혈증을 나타내면서 상동 챌린지에 대해 멸균에 가까운 보호를 제공합니다. 이러한 균주는 최근에 상용화되었지만, 백신 접종 후 동물 간 혈청형에서 병원성 회귀가 확인되었기 때문에 USDA로부터 백신 철회 통지를 받았습니다[
33,34].
현재까지 개발된 많은 ASF-LAV 중 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR에 대한 임상시험은 소수에 불과하다. 특히, ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR의 합리적인 개발은 ASFV-G 게놈에서
I177L 유전자를 삭제하여 얻은 약독화 생백신 후보인 ASFV-G-∆I177L의 개발을 촉진했습니다[
20]. ASFV-G-ΔI177L은 고용량 비경구 접종에서도 안전한 것으로 간주됩니다. 또한, 상대적으로 적은 용량에서도 매우 독성이 강한 부모 변종 ASFV-G에 대해 매우 효과적입니다. 그러나 이 약독화 바이러스는 돼지 대식세포의 1차 배양에서만 복제되기 때문에 상업적인 대량 생산에 어려움이 있습니다. 이 백신 후보 물질은 ASFV-G-∆I177L의 유도체 균주로, PIPEC 돼지 세포주에서 효율적으로 복제되는 LVR이 삭제되었습니다. 또한, ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR은 기존 세포주에서 복제할 수 있도록 합리적으로 설계된 최초의 고효율 ASF 백신 후보물질입니다. 또한 상업 생산에 적합한 것으로 간주됩니다[
20].
이미 임신한 모돈에서 확인된 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신의 효능과 안전성을 조사하고자 했다(게재 제출). 본 연구에서는 백신 안전성 및 효능을 평가하기 위해 백신 접종 후 상동성 악성 ASFV 필드 균주에 감염된 돼지인 A군과 백신 유전체 검출 및 항체 지속성 분석을 위해 접종 후 56일 동안 사육한 사육 돼지인 B군이라는 두 가지 독립적인 동물실험에서 이 백신의 안전성과 효능을 추가로 평가하였다.
A군에서는 백신을 접종한 돼지에서 완전한 보호가 확인되었으며, 접종 2일째부터 돼지 4마리 중 2마리의 전혈에서 ASF 유전체 복사(
p72)가 검출되었습니다. 검출은 14에서 28 dpc까지 일정한 수준(Ct = 2.53 ± 6.46)에서 확인되었습니다. 더욱이 백신군의 ASF
p72 검출률은 대조군보다 45% 이상 낮았다. 시간이 지남에 따라 백신 게놈 복제가 줄어들면 결국 바이러스 제거로 이어질 수 있습니다. ASF 백신 바이러스 배출의 관점에서 볼 때, ASFV 유전체는 챌린지 이전 시점(28 dpv)까지 전혈에 비해 직장 및 구강 면봉에서 매우 낮은 수준으로 검출되었으며, 개별 동물 간에 검출이 일관되지 않았습니다. 전반적으로 ASFV 게놈 검출 빈도는 직장강보다 구강에서 더 높았다. 그러나 챌린지 이후 ASFV 게놈은 모든 동물의 직장 및 구강 면봉에서 낮음에서 중간 수준으로 일관되게 검출되었습니다.
부검 결과 백신 접종 후 문제가 발생한 돼지의 장기에서 ASF 병변은 발견되지 않았다. 마찬가지로, 대부분의 장기에서 특이적인 조직병리학적 병변이 관찰되지 않았다. 그러나 주요 관심사는 백신을 접종한 동물에서 백신 바이러스가 배출되는 것과 백신 접종 후 챌린지 바이러스의 배출에 대한 평가입니다. 백신을 접종한 동물의 바이러스 배출은 안전성과 효능 모두에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 백신 접종 후 특정 기간 동안 백신 바이러스와 관련된 ASF
p72 게놈을 검출하면 바이러스 복제를 억제하고 상동 바이러스에 대한 무균 면역 발달을 촉진할 수 있습니다[
16,19].
우리는 어떤 약독화 생백신도 완전히 완벽한 것으로 간주될 수 없다는 것을 인정합니다. 백신 접종 후 바이러스 제거는 백신에 의해 자극된 면역 체계가 신체에서 바이러스를 제거하는 과정을 말합니다. 효과적인 백신은 바이러스를 현저히 줄이고 궁극적으로 박멸할 수 있는 강력한 면역 반응을 유도해야 합니다. 그러나 바이러스 제거율과 효율성은 백신의 유형, 숙주의 건강 상태, 특정 바이러스의 특성을 포함한 여러 요인의 영향을 받습니다. ASF의 경우, 백신 접종이 바이러스 존재 및 탈락을 줄이는 데 미치는 영향을 계속 탐구하기 위한 연구가 진행 중이며, 백신을 접종한 동물에서 효과적인 바이러스 제거를 달성하는 것이 얼마나 복잡한지를 강조하고 있습니다.
백신 접종 후 일정 기간 동안 Ct가 45< 검출 가능한 백신 게놈 사본이 없는 동물은 챌린지 바이러스에 대한 효과적인 방어력을 나타내지 않았고 결과적으로 사망했습니다. 이러한 결과는 이전 연구에서 보고된 결과와 일치합니다[
16,19].
또한, ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 지속적으로 높은 수준의 항체를 검출하는 것은 면역 보호 효과를 평가하는 데 특히 중요합니다. 본 연구에서 백신을 접종한 모든 동물은 시간이 지남에 따라 지속적으로 증가하는 우수한 항체 양성을 보였습니다. 이러한 결과는 백신 접종 후 ASF
p72 게놈 및 항체 수치가 높은 동물이 100% 생존율을 보인다는 것을 보여줍니다.
그룹 B는 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 국내 돼지의 장기 사육을 위한 임상시험의 일환으로 백신 게놈 및 항체 지속성을 검출했습니다. 백신 접종 4일째에 돼지 4마리 중 3마리에서 낮은 수준의 ASF p72 게놈이 검출되었으며, 시간이 지남에 따라 백신 접종 28일째에 더 많은 게놈 사본이 검출될 수 있었습니다. 그러나 백신 접종 후 약 42일 후에 게놈 복제 수의 점진적인 감소가 관찰되었습니다. 이에 반해 11일째 돼지 4마리 중 2마리에서 백신 항체가 검출되어 항체 양성률 기준인 S/N%가 40<, 24일째부터는 상대적으로 높은 수준의 백신 항체(S/N% = 19.05 ± 4.76)가 검출되었습니다. 백신 접종 후 1개월이 넘은 42일째(S/N% = 7.23 ± 2.25)에도 높은 항체 수치가 유지되었으며, 접종 후 약 2개월이 지난 56일째에도 더 높은 ASF 백신 항체(S/N% = 5.38 ± 2.24)가 관찰되었습니다. 본 연구에서 높은 ASF 백신 항체의 지속성은 고독성 필드 ASFV 균주에 노출되면 적절한 보호를 제공한다는 것을 시사합니다. ASF를 장기간 접종한 그룹에서는 백신 접종 후 14일에서 18일 사이에 돼지 4마리 중 3마리에서 직장과 구강에서 백신 바이러스 흘림이 낮은 수준으로 감지되었습니다. 그 결과, 안락사 시점인 56일째에 단 두 마리의 돼지에서만 구강 내 매우 낮은 수준의 바이러스 흘림이 관찰되었습니다(Ct = 42.7 ± 2.3). 이러한 결과는 ASF-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 투여 후 약 2개월 후에 백신 바이러스 배출이 미미하고 유의하게 제한되었음을 나타냅니다. 그러나 실험에 더 많은 동물을 사용할 수 없었고, ABSL-3의 공간 및 시간 제한으로 인해 모두 56일째 되는 날에 안락사되었습니다.
ASF 예방은 전 세계 양돈 산업의 주요 과제입니다. 지난 수십 년 동안의 과학적 발전으로 서브유닛 백신, 불활성화 백신, 다중 유전자 삭제 백신(약독화 생백신), 유전자 및 천연 약독화 백신에 중점을 둔 다양한 백신 개발 전략이 발전할 수 있었습니다. 현재까지 가장 현장에서 사용할 수 있는 백신 후보는 약독화 생백신입니다. 25가지 ASFV 유전자형에 대한 효과적인 예방 또는 치료 전략은 아직 부족하지만, 각 대륙에서 가장 흔한 유전자형인 유전자형 II에 대한 동물 보호에는 상당한 진전이 있었습니다[
35]. 임상시험에서 ASF 약독화 생백신의 효능이 입증되었지만, ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 후보에 대한 결과는 제한적입니다.
이 연구는 일부 한계가 있었지만 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신은 현재까지 개발된 약독화 생백신 후보 물질과 동일한 수준의 ASFV에 대한 보호를 제공한다고 생각합니다. 앞으로의 과제에는 충분한 양의 사육 돼지에게 백신을 접종하고 백신 항체 수준이 평균 시장 연령의 5-6개월까지 유지되도록 하는 것이 포함됩니다. 또한, 1차 접종 후 백신 항체의 변곡점을 파악하고 이에 대한 이의를 제기하기 위한 향후 연구가 필요합니다. 마지막으로, 추가적인 무균 면역을 입증하기 위해 ASF 표적 조직(표적 장기, 전혈, 구강 면봉 등)에 대한 충분한 분석이 필요합니다.
5. 결론
수십 년 동안 ASF 약독화 생백신은 수많은 임상시험을 통해 다양한 유전자 변형을 통해 개발되어 왔습니다. 그러나 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 후보물질에 대한 임상시험은 현저히 제한적인 실정이다. 본 연구에서는 WOAH Biological Standard Commission 백신 생산 기준을 엄격히 준수하고 고순도 백신으로 임상시험을 진행하였습니다. 백신의 순도는 세포주 통과 중 돌연변이의 가능성을 철저히 제거함으로써 달성되었습니다. 본 연구에서는 저용량 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 상동 챌린지에서 우수한 효능과 안전성을 보고합니다. 또한, ASF 백신 항체는 접종 후 약 2개월 동안 상당히 높은 수준으로 유지되었습니다. 이러한 결과는 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 후보물질이 양돈산업에서 ASF 감염을 완화하는 역할을 할 수 있음을 확인시켜줍니다.
보충 자료
다음 지원 정보는 다음에서 다운로드할 수 있습니다:
https://www.mdpi.com/article/10.3390/ani15040473/s1, 표 S1: 그룹 A, ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 챌린지의 직장 및 구강 면봉 샘플에서 qPCR에 의한 백신 게놈 사본 검출. 표 S2: ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 백신 접종 후 직장 및 구강 면봉 샘플에서 qPCR을 사용한 그룹 B(장기), 백신 게놈 복사.
저자 기여
개념화, J.H.S., W.J. 및 S.C.M.; 방법론, S.J.L. 및 Y.K.; 형식 분석, J.H.S., S.J.L. 및 S.A.C.; 조사, K.S.A., S.Y.L., X.Z., D.S.K., Y.K., S.J.L., S.A.C., S.P.S., W.K., Y.S. 및 D.T.; 작문—원문 준비, J.H.S.; 집필—검토 및 편집, J.H.S. 및 S.A.C.; 감독, W.J. 및 J.H.S. 모든 저자는 출판된 버전의 원고를 읽고 동의했습니다.
자금
이 연구는 코미팜과 환경부 국립야생동물질병통제연구소(허가번호 NIWDC-2023-RP-002)의 지원을 받았다.
Institutional Review Board 성명서
동물 연구 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 JBNUNON 01-022-2023 및 JBNUNON 2024-049)의 승인을 받았습니다.
정보에 입각한 동의서
해당 사항 없음.
데이터 가용성 선언문
본 연구의 결과를 뒷받침하는 데이터와 설문지는 합당한 요청에 따라 교신저자가 이용할 수 있다.
승인을
ASF 임상시험을 위해 ABSL-3 시설을 승인한 정부 기관인 환경부 야생동물질병통제예방야생동물질병대응팀(Wildlife Disease Control and Prevention Wildlife Disease Response Team)에 감사드립니다. 우리는 또한 Eun-Mi You의 탁월한 조직병리학적 도움에 감사드립니다.
이해관계의 충돌(Conflicts of Interest)
코미팜 인터내셔널(주)은 미국 농무부(USDA)로부터 허가를 받은 백신을 취득하였으며, 이 백신을 상업적으로 판매하기 위한 임상시험을 진행하고 있습니다(미국 특허 16580058). Douglas P. Gladue와 Manuel V. Borca는 아프리카돼지열병에 대한 약독화 생백신으로 ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 및 ASFV-G-ΔI177L에 대해 미국 농무부에 특허를 출원했습니다. 저자 최선아, 이수진, 문성철, 안근승, Xinghua Zheng, 김도순, 이세영, 신승표, 수향향은 코미팜 인터내셔널에 소속되어 있으며, 환경부 국립야생동물질병통제연구소(NIWDC-2023-RP-002)로부터 연구비를 지원받았으며, 동물질환 백신 개발 및 임상시험에 종사하고 있다. 저자 동섭 탁은 충남대학교 수의과대학에 재직 중이다. 저자 김연지, 김원준, 신용우, 정원화는 국립야생동물질병통제예방연구소 야생동물질병대응팀에서 근무했다. 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
약어
이 사본에는 다음과 같은 약어가 사용되었다.
| 증권 시세 표시기 | 백신 접종 후 일수 |
| DPC (디씨) | 챌린지 후 일수 |
| 증권 시세 표시기 | 아프리카돼지열병 바이러스 |
| LAV (라브) | 약독화 생백신 |
| 피펙 | Plum Island 돼지 상피 세포 |
| 우와 | 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health) |
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