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항체 단백질 공학과 항체공학이 같은 건지 모르겠지만(같은것 이겠죠. 항체가 단백질로 구성되어 있으니, 항체단백질 공학을 항체공학이라고도 하는것 같다는 생각이 듭니다.) 관련 글을 하나 올리죠. 항체단백질 공학의 발전방향 진재호 식품의약품안전청 생물학평가부 보건연구사 여는말 새 천년을 앞두고 모든 과학기술이 진보를 거듭하고 있지만 그 중 가장 급속도로 발전하고 있는 학문이 컴퓨터공학과 생명공학일 것이다. 이들 두 학문의 발달이 상호작용을 일으켜 만들어낸 새로운 과학기술이 컴퓨터공학에선 바이오칩(Biochip)과 바이오센서(Biosensor) 기술이고 생명공학에선 단백질공학기술이다. 바이오칩은 아직 개발초기 단계이긴 하지만 궁극적으로는 지금의 컴퓨터의 계산속도나 기억용량을 혁신적으로 증가시킬 수 있는 대안으로 제시되고 있고, 바이오센서는 제어계측공학에서 혁신적인 기술로 많은 응용모델이 있지만 다음 기회로 그 설명을 미루기로 하겠다. 지금 말하고자 하는 단백질공학은 쉽게 정의하자면 경제적으로 효용가치가 높은 단백질을 대량으로 생산하는 기술로서 처음에는 자연계에 존재하는 단백질을 대량으로 생산하는 것에 초점이 맞추어져 발전했지만 많은 단백질의 구조가 알려지기 시작하고 컴퓨터의 하드웨어와 소프트웨어의 발달로 인해 Simulation에 의한 분자 모델링 기술이 보편화되어지자 자연계에 존재한 적이 없던 경제적 효용가치가 높은 새로운 단백질을 만들려는 시도가 생겨나기 시작했다. 이런 새로운 시도의 표적이 된 단백질이 바로 항체단백질이다. 항체단백질이 선택된 이유는 항원-항체결합의 특이성과 β-sheet로 이루어진 단단한 골격구조에 있다. 항체단백질을 이루는 90%이상의 아미노산들은 -우리가 Framework Regions이라고 부르는 것-종 특이적으로 같은 아미노산을 가미며 종이 ekmf더라도 β-sheet로만 이루어진 같은 골격을 가지고 여기에 몇 개의 아미노산이 돌연변이에 의해서 미치지 않는 경우가 많다. 하지만 항체단백질의 10%미만인 -우리가 Hypervariable Region Ehsms Complementarity Determining Regions(CDRs)라고 부르는 것-항체 특이적인 항원의 epitope에 결합하는 부위에 의해 각 항체 특이성이 결정되어진다. 쉽게 말하면 CDR 부위의 아미노산들만 적당히 잘 바꾸어주면 약간의 Frame Region의 변화를 가져온다 할지라도 우리가 원하는 특정 단백질에만 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 만들 수 있다는 얘기가 된다. 더욱이 CDR 부위는 항체단백질 상에서 β-loop구조를 이루고 있어 어떤 아미노산들로 바뀌어지더라도 전체 항체단백질의 구조에는 영향을 거의 미치지 않는다. 다양한 종에서의 많은 항체단백질의 DNA 염기서열과 단백질 1차 구조를 이루는 아미노산 서열이 Kabat 등에 의해서 Database화되어 있어 누구나 쉽게 단백질공학에 응용되기 쉽다는 것도 큰 장점이 된다. 결국 항체단백질은 가장 인위적으로 조작하기 쉬운 단백질인 것이다. 인간화 항체의 개발 항체단백질을 치료제로서 사람에게 처음 사용하기 시작한 것은 1920년대 초반 Leukemia를 치료할 목적으로 토끼의 항혈청을 사용하면서 부터이다. 1970년대 Hybridoma 기술이 개발된 바 광범위한 치료대상에 특이적으로 작용하는 설치류의 단클론항체들을 생산할 수가 있게 되었다. 사람의 단클론항체를 치료제로서 사용하지 않고 설치류의 단클론항체를 사용하게 된 데에는 윤리적인 문제와 자기 항원(self-antigen)에 대한 Tolerance 같은 이유 때문이다. 설치류 단클론항체를 치료제로서 사용시 사람항원에 대한 특이성과 결합능역이 좋고, 대량 생산이 가능하다는 장점이 있으나 설치류의 항체가 환자에게 면역반응을 유도해서 체내에서 설치류의 항체를 빠르게 제거하는 Rapid Clearnance가 나타난다. 또 설치류의 항체는 사람 항체의 Fc Redion과 다른 아미노산들로 이루어져 있어 사람 항체의 Fc Region에 의해 이루어지는 CDC(complement dependent cytoxicity)나 ADCC(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) 같은 Human Lmmune EFFECTOR FUNCTION을 유도하지 못한다. 가장 중요한 것은 설치류의 항체를 사람에게 계속 투여할 경우 그 환자에게서 allergic side effect를 나타낼 수가 있다는 것이다. 설치류의 항체를 사용할 때 나타나는 이런 문제점들을 해결하기 위해서 설치류나 다른 종에서 생산된 항체의 인간화(humanize)를 고려하였다. 항체의 인간화에는 두 가지 방법이 있는데 먼저 설치류 항체의 variable region 전체를 사람 항체의 constant region에 옮기는 rodent-human chimeric antibody를 만드는 것이다. 전체 항체단백질의 35%가 설치류 항체에 기원한 것이므로 rodent antibody보다 덜 하지만 여전히 사람에게 투여할 항-variable region 면역반응을 유도하게 된다. 다른 하나는 CDR grafting으로 설치류 항체의 CDRs(antigen binding loops)를 사람 면역글로블린에 옮기는 것인데, "reshaped" human variable domain을 constant domain과 연결한 것이므로 전체 항체단백질의 9%만이 설치류 항체에 기원한 것이므로, 사람에게 투여할 경우 항체에 대한 면역 반응이 거의 나타나지 않는다. 극소수의 사람에게서 idiotypic antibody에 의한 idiotypic 면역반응이 나타날 수는 있다. 항체단백질의 인간화는 설치류 항체의 CDRs을 사람 항체의 frame 부위의 변화를 최소한으로 줄이는 방향으로 진행되며 항원-항체 결합력은 원래의 설치류의 항체와 거의 유사하게 나타난다. 대량생산을 위한 미니항체의 개발 인간 항체를 생산하기 위해서는 배양된 동물세포를 사용해야 하는데 여기에는 막대한 비용이 소요된다. 따라서 과학자들은 F뮤, Fv, scFv와 같은 미니항체를 대장균에서 합성하는 방법을 개발해 왔다. 이들은 항체에서 항원을 인식하는 변이부위만으로 구성된 단백질로서 대장균에서 대량으로 그리고 저렴한 비용으로 합성할 수 있다. 두 개의 heavy chain과 두 개의 light chain으로 이루어진 항체는 variable region(V)과 constant region(C)으로 구성되어 있다. 현재 미니항체는 효소나 유전공학 기법으로 F(ab)2, Fab, Fc, Fab', scFv 등의 항체 단편(antibody fragment)으로 만들어져 응용되고 있다. 항체-항원 반응은 heavy chain의 variable region(VH)과 light chain의 variable region(VL)에 의한 3차 구조에 항원이 결합함으로써 이루어진다. 약 100여개의 아미노산으로 이루어진 variable region은 다양성이 높은 hypervarible region과 다양성이 적고 구조적 역할을 하는 부분으로 이루어져 있는데 hypervariable region은 각 항체에 따라 보존되어 있다. 구조를 이루는 region이 hypervariable region을 지지하므로 한 개의 VL 부분을 연결하여 단백질로 만들 수 있다. Single chain antibody(scFv)라고 일컫는 이러한 단백질은 VL과 VH를 약 10-25개 아미노산으로 구성된 linker가 연결시킴으로써 하나의 polypeptide를 형성하도록 유전공학적으로 제조된다. 특정 항원에 대한 단일클론항체의 variable region fragment(Fv)단편은 모체항체의 항원 결합능력을 지닌 가장 작은 단위로 단일클론항체의 대체로 사용될 수 있다. 그러나 문제는 이러한 미니항체들이 체내에서 불안정하여 빠른 속도로 제거되기 때문에 항체가 오래 지속되어야 할 경우에는 사용이 곤란하다는 점이다. 미국 Celltech Therapeutics 사의 A. P. Chapman을 비롯한 연구팀은 이러한 미니 항체를 polyethylene glycol(PEG) 분자에 연결하는 간단한 방법을 사용하여 안정성을 향상시킬 수 있다는 사실을 발견하여 Nature Biotrchnology 최근 호에 그 연구결과를 발표하였다. 연구팀은 먼저 F뮤 형태의 항체에 2-iminothiolane 작용기를 도입하고 PEG-maleimide와 반응시켰다. 그 결과 만들어진 PEG-항체는 체내에서 반감기가 항체에 부착된 PEG 숫자가 증가할수록 항원에 결합할 수 있는 결합력은 오히려 감소하였다. 항체의 항원 결합부위에서 멀리 떨어진 부분에 유연한 팔을 만들고 그 부분에 PEG를 결합시킬 수 있도록 항체를 조작하였다. 그 결과 마침내 항원에 대한 결합력을 완전히 유지하면서도 안정성과 생체 친화성이 향상된 항체를 만들 수 있었다. 이러한 접근법은 저렴한 가격으로 항체를 임상에 사용할 수 있도록 하는데 기여를 할 수 있을 것으로 보인다. 그리고 Fv나 scaFv와 같은 다른 형태의 항체에 이 방법을 사용해 보는 것도 흥미로운 시도가 될 것이다. Bispecific scFv(bscFv)의 제조 보통 15개의 아미노산 linker를 가진 scFv monomer는 정제 후 안정한 monomer와 dimer의 혼합 형태로 존재함이 보고되었다. 구조적으로 2개의 scFv 분자가 covalent 또는 noncovalent interactions을 통해 complex를 이루어 dimer를 형성하여 두 개의 binding site를 갖는 bivalent scFv 성격을 지니게 되는데 이것은 crystal structure 연구로 증명되었다. 연구결과 minomer와 dimer 형성 비율은 scFv에 따라 각각 다르게 나타나고 monomer로만 존재하는 scFv도 보고되었다. scFv는 antigen과 1개의 결합부위를 가지고 있는데 scFv 2분자를 chemical crosslinking 또는 covalent 결합을 통해 dimer 형태인 bispecific Fv(diabody)를 만들어 2개의 결합부위를 가진 최소의 항체로서 specificity를 증가시키려는 연구가 보고되었다. scFv의 C-terminal에 Cys를 포함하는 peptide tail을 하여 두 분자의 scFv가 disulfide bound를 형성하여 bivalent한 anti-erbB2 bsFv가 만들어지도록 설계한 방법도 보고되었다. C-terminal에 coiled-coil helix나 helix-turn-helix가 antiparallel하게 amphipathic helix의 dimerization domain을 붙여 둘 또는 네 개의 helix bundle을 형성하도록 설계한 보고가 있는데, 후자의 경우 antibody만큼 affinity와 안정도를 지녔다. 또한 scFv 두 개의 DNA 단편을 하나의 gene으로 제조함으로써 만들어진 한 개의 polypeptide가 안정된 bispedific dimer(diabody)를 형성하도록 하였다. 이와 같이 제조한 bivalent Fv는 Fab이나 monovalent scFv와는 달리 2개의 antigen binding site를 갖고 있어 항원에 대한 높은 친화력이 있어 tumor localization에 탁월한 표과를 보였다. 따라서 bispecific Fv는 실질적인 affinity constant가 IgG(immunoglobulin G)와 같은 binding을 갖고 있으며 단일클론항체의 크기보다는 훨씬 작아 가장 이상적인 형태라고 볼 수 있다. 맺는말 이제 항체는 임상의사들이 질병의 치료에 실제로 사용하는 의약품 가운데 하나로 자리를 잡고 있다. 예를 들어 종양괴사인자(tumor necrosis factor)에 결합하는 항체는 류머티즘성 관절염의 치료제로 사용되고 있고, OKT3 항원을 인식하는 항체는 장기이식에 따른 거부반응을 억제하기 위해 사용되고 있다. 또 심장약인 digoxin을 과다하게 사용한 경우에는 양에서 분리한 digoxin에 대한 항체가 사용되며, 전이된 암을 치료하기 위해 몇 종류의 단클론화 항체가 시험중에 있다. Table에서 보는 바와 같이 미 FDA에서 승인된 인간화된 단일클론항체들을 열거하고 있는데 일부는 우리나라에서도 희귀의약품으로 판매가 되고 있다. 미국에서는 FDA의 CBER(Center for Biologics Evaluation Research)내에 Division of Monoclonal Antibodies가 있어 의약품으로 사용할 목적으로 있다는 점을 비추어 우리 식품의약품안전청도 그에 준하는 대비가 있어야 할 거승로 사료된다. 급속도로 발전하는 항체단백질의 치료제로서의 개발현황들을 정리하면서 이렇게 많은 과학자들이 다양한 방법으로 개발한 의약품을 검토하기에는 본인의 노력이 부족함을 뼈저리게 실감하며 더 노력해야겠다고 스스로에게 채찍질을 해보기도 하지만 밤에 잠만 설쳤다

물질명	제품명	개발회사	허가일	적 응 증
Abcizimab	Reo Pro	Centocor, B.V	11/97	경피 관상동맥 질환
Rituximab	Rituxan	Genetech	11/97	B세포 non-Hodgkin's Iymphoma
Daclizumab	Zenapax	Roche, Inc	12/97	신장조직이식을 받은 환자의 급성 기관거부반응
Bacilizimab	Simulect	Novartis	5/98	신장조직이식을 받은 환자의 급성 기관거부반응
Palivizumab	Synagis	Med Immune, Inc	6/98	Respiratory Syncytial Virus(RSV)가 일으키는 호흡기계질환의 예방
Ikflizimab	Remicade	Centocor, Inc	8/98	Crohn's disease
Trastuzumab	Herceptin	Genetech	9/98	유방암 환자의 치료 또는 진단